DNA RNA の受託合成、プロテオーム受託解析、ペプチド抗体作製
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接着性細胞のsiRNAトランスフェクション方法　　　（浮遊性細胞用プロトコールはこちら）

１．細胞のプレーティング
　　トランスフェクションをする前日に、細胞を 3.5 cm プレートに播き、一晩培養(37℃、5% CO₂)してください。
　　※細胞量は、20-50 % コンフルエントにしてください。

２．siRNA dilution の調製
　　アニーリングした 20 μM siRNA (10 μL)を Opti-MEM medium (170 μL)で希釈してください。

３．Transfection Reagentの調製
　　OligofectAMINE(4 μL、Invitrogen社)を Opti-MEM medium (16 μL)で希釈し、室温で 5〜10分間静置してください。

４．siRNA dilution を Transfection Reagent に加え、軽く混合し、室温で15〜20分間静置してください。
　　※混合の際、ボルテックスは使用しないでください。

５． 細胞を Opti-MEMで洗浄後、Opti-MEMを 800 μL 加えてください。

６．4 の Transfection mixture を細胞に加え（Total 1 mL）軽く混合してください。
　　（siRNA 最終濃度は 200 nM。20 nM 程度でも同等の効果が得られる場合があります。）

７．37℃、5 % CO₂条件で、4時間培養後、血清を 300 μL 加えてください。

８．2〜4日目に細胞を回収し、目的遺伝子の発現をウエスタンブロットや RT-PCRで調べてください。
　　（一般には、24〜72時間後に最も強く発現の抑制がかかります。）
　　
　　※注意：遺伝子発現抑制効果は、トランスフェクションの2日後から1週間程度継続します。
　　　さらに長期間 RNAi を行う場合は、siRNAのトランスフェクションを繰り返すか、siRNA様遺伝子の発現ベクターを
　　　培養細胞に stable transfectionする方法があります。
　　　後者の実験の際、アダプターDNAのベクターへのクローニングには、５’リン酸化オリゴをお試しください。
　　　（クローニング効率が上昇します。）

　　※細胞内で siRNAを発現するベクターも市販されています。（2002年11月）
　　　pSilencer 1.0-U6（U6プロモーターあり、薬剤耐性マーカーなし、Ambion社）。
　　　pSUPER（H1プロモーターあり、薬剤耐性マーカーなし、OligoEngine社）など。